基于转录组测序的银杏类*酮生物合成关键基

银杏GinkgobilobaL.又名公孙树、鸭脚子，单科单属裸子植物，世界 孑遗物种、长寿树种，系我国特产[1]。银杏是现存的最古老的树种，中生代曾广泛分布于北半球，现仅在我国浙江天目山地区有野生植株，素有“植物界的活化石”之称。银杏为我国传统中药，在元代《日用本草》、明代《本草品汇精要》及清代《本草逢源》等多种本草药集中均有记述[2]。

年，德国Schwabe药厂将银杏叶提取物（EGb）引入临床医疗从而使银杏进入世界研究者的视野，随后大量研究发现[3]，EGb具有广泛的药用功能。EGb主要药用成分为类*酮（24%）和萜内酯（6%）。银杏类*酮在改善脑功能、促进血液循环、调节免疫系统、清除自由基、抗氧化、抗衰老等方面都有显著效果[4-7]，常用于预防和治疗老年痴呆、卒中、脑梗死等老年常见病[8-9]。以银杏叶提取物（EGb）制备的药剂已在欧洲、亚洲临床医学上广泛应用，而如何提高作为EGb主要成分的类*酮物质的含量，已成为迫切需要解决的问题。

迄今，在模式植物中与类*酮生物合成相关的功能基因均已被克隆并进行了广泛地研究，从而使类*酮生物合成途径成为植物中研究得最为深入的次生代谢途径[10-12]。但在银杏中类*酮主要以其提取工艺、药用价值、药理作用研究居多，生物合成分子机制研究相对较少[13-14]。目前，提高银杏类*酮产量的方法主要以激素调控、前体物质添加、培养条件优化等为主[15-16]。年11月银杏基因组测序完成，为银杏转录组测序提供了参考基因组，有利于从分子生物学水平深入研究银杏次生代谢物生物合成的调控机制。本研究通过转录组测序分析类*酮生物合成途径的关键基因及其表达模式，以期在分子水平寻找提高银杏类*酮产量的方法，为将来利用基因工程技术改造银杏基因组，培育高产、高品质银杏叶品种奠定理论基础。

1材料与方法

1.1材料

植株种植于中南林业科技大学，经中南林业科技大学王义强教授鉴定为银杏科银杏属植物银杏GinkgobilobaL.。分别在4月（幼叶期）、9月（成熟叶期）采集银杏幼年树（10年生）、成年树（30年生）3个单株树冠叶片，将叶片材料制成混合样品。样品标记为T1～T4，液氮速冻后保存于?80℃备用。

1.2转录组测序与分析

1.2.1总RNA的提取与文库构建使用E.Z.N.A.PlantRNAKit（Omega，R-01）提取样品总RNA。将检测满足测序要求的总RNA进行文库构建。用带有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA，加入FragmentationBuffer将mRNA进行随机打断，以mRNA为模板用六碱基随机引物（randomhexamers）合成第1条cDNA链，再合成第2条cDNA链，经过纯化的双链cDNA再进行末端修复、加A尾并连接测序接头， 通过PCR富集得到cDNA文库。

1.2.2转录组测序及与参考基因组比对转录组高通量测序委托北京百迈客生物科技有限公司完成。使用IlluminaHiSeq测序平台对cDNA文库进行测序得到大量rawreads，过滤后得到cleandata，与银杏基因组进行序列比对，得到的mappeddata，进行插入片段长度检验、随机性检验等文库质量评估。

1.2.3基因功能分析与差异表达基因筛选将得到的全部Unigene与Nr（NCBInon-redundantproteinsequences）数据库比对，以E值＜1×10?5为阈值，利用BLAST算法进行基因功能注释。同时，将Unigene分别与GO、COG、KEGG、Swiss-Prot、Pfam数据库比对，分析预测基因的功能分类和参与的生物学途径。

利用EBseq平台分析差异表达基因（differentiallyexpressedgenes，DEG），使用FPKM（fragmentsperkilobaseoftranscriptpermillionfragmentsmapped）法[17]计算基因的表达量，作为衡量转录本表达水平的指标，使用FDR（falsediscoveryrate）进行可信度检验。在差异表达基因检测过程中，将差异倍数（foldchange）≥2且FDR＜0.01作为筛选标准。根据基因在不同样品中的表达量进行差异表达分析、差异表达基因功能注释和功能富集等表达水平分析。

2结果与分析

2.1银杏转录组测序分析

2.1.1测序数据质量分析通过IlluminaHiSeq测序平台获得rawreads后，通过过滤去除低质量片段，参照银杏基因组拼接组装，各样品数据统计如表1所示。各样品cleandata均达到7Gb以上，碱基质量超过Q30的比例均在90%以上，且GC含量均在50%左右，说明测序组装效果好，符合后续分析要求。分别将各样品的cleanreads与银杏参考基因组进行序列比对，比对效率均达75%左右，说明测序精度高。

2.1.2测序数据注释信息分析组装拼接后共得到条Unigene，使用BLAST软件将Unigene与常用的各大数据库进行比对分析，获得注释的Unigene共条。从表2可以看出，在COG、GO、KEGG数据库中注释的Unigene数都在0条以下，其他数据库的注释数则都超过0条，在eggNOG和Nr数据库中的注释数甚至达条以上。同时长度大于bp的Unigene有条，约占注释Unigene总数的52.6%。

Unigene与Nr数据库进行BLAST比对发现，银杏转录组测序得到的Unigene与北美云杉Piceasitchensis(Bong.)Carr.的Unigene相似数最多，达到了31.14%（图1）。其次是无油樟AmborellatrichopodaL.和莲NelumbonuciferaGaertn.Fruct.etSemin.Pl.。其他几个物种相似数量较少，约占2%～5%，占比低于1%的物种归为一类（其他），共占32.96%。与银杏比对上的基因只有条，占2.00%，说明银杏相关基因研究还较少。

2.2基因功能分析与差异表达基因筛选

2.2.1类*酮生物合成相关基因筛选根据对4个样品的整体注释，寻找类*酮生物合成途径相关基因的注释。同时对KEGG数据库类*酮生物合成（ko）和苯 生物合成（ko）这2条途径进行基因注释分析。发现类*酮生物合成相关基因均被注释到，且这些基因均注释有多条Unigene。注释到的功能基因，见表3。

对4个样品之间基因的表达相关性进行比较，从图2可以看出，T1和T3、T2和T4之间相关性系数更高，即基因在两个样品中表达模式更相近。说明相对于成年树与幼年树在叶同时期之间的差异，叶不同时期（幼叶与成熟叶）之间的差异更显著。

2.2.2差异表达基因KEGG富集分析对4个样品的Unigene进行差异表达筛选共发现个DEG，占总被注释Unigene的14.55%。Unigene与KEGG数据库比对，个基因被注释，涉及的通路个，其中富集的前50条通路统计如图3所示。富集通路主要集中在新陈代谢（metabolism）部分，其中Unigene有50条以上的通路为：苯 类生物合成（phenylpropanoidbiosynthesis）、淀粉和蔗糖代谢（starchandsucrosemetabolism）、植物激素信号转导（planthormonesignaltransduction）、类*酮生物合成（flavonoidbiosynthesis）以及苯丙氨酸代谢（phenylalaninemetabolism）。说明与类*酮合成相关的通路是不同样品之间DEG的主要富集之一。

2.3类*酮生物合成相关基因的表达分析

2.3.1类*酮生物合成关键基因聚类分析银杏类*酮根据其结构差异一般可分为*酮、*酮醇、异*酮、*烷酮、*烷醇、花色素等6大类[7-18]。其中，槲皮素、山柰酚、异鼠李素这3种*酮醇是银杏叶总*酮的主要成分，也是EGb质量控制中检测的标准[19]。

通过对上一步类*酮合成相关途径基因进行注释筛选，去除极低表达（FPKM＜0.1）Unigene，共筛选出50条在4个样品中差异表达的候选关键基因。对这50条Unigene进行基因表达聚类分析，从图4可以直观地发现，根据Unigene在不同样品中的表达水平，50条Unigene可以聚为3类表达模式。除了中间的5个Unigene相反外，其他Unigene均在T1和T3高表达，即成年树和幼年树4月的幼叶中高表达；T2和T4低表达，即成年树和幼年树9月的成熟叶中低表达。同时，4个样品聚为两类，T1和T3一类，T2和T4一类，与图2结果一致。2.3.2类*酮生物合成关键基因表达分析植物在发育的不同阶段、一年中生长的不同时期其代谢是有一定差异的[14,20]。本实验对银杏成年与幼年阶段、幼叶（4月）与成熟叶（9月）类*酮生物合成途径中的多个关键结构基因的表达进行了比较分析。由于这些基因均有多个Unigene，通过分析发现这些Unigene的表达量虽相差很大但其表达模式是一致的，故以 表达量的Unigene作为注释基因表达丰度的衡量。

从图5可以看出，C4H、CHS、ANS、ANR和FOMT基因的表达量都超过了，在13个基因里表达量相对较高，F3′H、F3′5′H和FLS基因的表达量都不超过65，在13个基因里表达量相对较低。UFGT基因在各个样品中差异不显著，故图中未列出，这与张传丽等[21]研究结果一致。F3′H、F3′5′H在 *酮醇和*酮醇的合成中具有重要作用，FLS则直接催化合成多种*酮醇类，而这3个基因却低水平表达，阻碍了*酮醇合成的通量。同时PAL是类*酮生物合成途径的起始关键酶[13]，其基因表达水平也相对较低。DFR、ANS、ANR都属于花青素合成途径的重要酶类，这3个基因的表达量整体都很高，说明类*酮合成途径中间产物流向花青素合成途径的通量较大。

3讨论

3.1转录组测序分析类*酮生物合成

在植物体中类*酮合成途径是目前研究的最为清楚的次生代谢途径，类*酮物质在植物体内具有重要的生理意义，在植物的授粉、抗病虫害、抵御紫外辐射、与微生物的信号传递等诸多方面发挥重要作用[4,7,20]。医疗上，银杏类*酮相比较于其他植物类*酮具有更显著的药效和较低的*副作用[22-23]，而成为植物药用成分开发的热点。

年11月，银杏基因组测序破解[24]，研究人员分析了这个超大的基因组（＞10Gb，是拟南芥基因组的80多倍）。银杏基因组的完成填补了陆生植物史上的重要空白，为植物演化史以及银杏防御、保护、药用等研究提供了重要的遗传学基础。银杏基因组数据的公布极大地促进了银杏的系统研究，年初本研究组 时间进行了有参转录组测序。通过高通量测序，每个样品均产出超过7Gbcleandata，共获得条Unigene，其中注释到条，同时获得新基因条。对4个样品进行差异表达筛选，得到个DEG。并进一步通过KEGG通路对DEG进行注释，筛选出50条与银杏类*酮生物合成相关的候选基因，并进一步分析了基因表达。本研究前期测序获得的大量数据对后续研究类*酮生物合成途径提供了丰富的数据资料，并对进一步关键基因的筛选挖掘奠定了基础。

3.2银杏类*酮生物合成关键基因的表达

通过对银杏类*酮生物合成途径相关基因的表达分析，发现各关键酶基因均在幼叶中高表达，成熟叶中低表达，而成年树与幼年树在叶同时期各基因表达差异不显著。这与林琰等[25]关于银杏*酮醇苷在叶不同时期的含量测定结果相一致。

结果分析表明，在银杏类*酮合成途径的上游阶段，CHS和CHI基因的表达量相对较高，但PAL基因的表达量相对较低，这启发可以增强PAL基因的表达，以增加整条代谢通路的通量。F3′H和F3′5′H可以催化 山柰酚分别生成 槲皮素和 杨梅素，FLS分别催化 山柰酚、 槲皮素和 杨梅素生成山柰酚、槲皮素和杨梅素，同时，F3′H和F3′5′H也可以通过催化山柰酚生成槲皮素和杨梅素[10]。而根据结果分析，F3′H、F3′5′H、FLS作为合成各种*酮醇类的关键酶基因其表达量均很低，直接限制了*酮醇类的合成。故通过超表达载体构建与基因工程技术大幅度提高特别是F3′H和FLS基因的表达，从而提高*酮醇类的合成量在理论上具有一定的可行性。同时，DFR、ANS、ANR等基因的高表达致使下游花青素合成支路通量大，间接降低了*酮醇类合成量，为了提高银杏*酮醇类的含量，也可通过降低、抑制DFR、ANS、ANR基因的表达来实现。

综合以上分析，本研究利用转录组测序技术，筛选挖掘出了银杏类*酮生物合成途径的关键基因，并分析了各基因的表达特征，确定了银杏*酮醇类物质合成的限速酶基因，并对提高银杏类*酮产量特别是*酮醇类的含量做了分析探讨，为今后利用基因工程手段改造银杏遗传背景，提高银杏类*酮产量，提供了分子生药学理论基础。

参考文献（略）

来源：刘伟，王俊燚，李萌，董金金，何崇单，汪贵斌，郁万文，王义强.基于转录组测序的银杏类*酮生物合成关键基因表达分析[J].中草药,,49(23):-.

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